摘自《25-羥基維生素D檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》

維生素D是一種脂溶性類固醇衍生物，是人體必需的脂溶性維生素，經(jīng)紫外線照射后可轉(zhuǎn)化為維生素D2。人體從食物攝入或在體內(nèi)合成的膽固醇經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫膽固醇并貯存于皮下，經(jīng)紫外線照射后可轉(zhuǎn)化為維生素D3。維生素D主要有維生素D3（膽鈣化甾醇）和維生素D2（麥角鈣化甾醇）兩種形式。其水平受很多因素的影響，主要包括紫外線輻射、膳食補(bǔ)充、年齡和肥胖、種族和民族因素等。維生素D本身不具有生物活性，需要發(fā)生2次羥基化轉(zhuǎn)化為生物活性形式。第1次羥基化發(fā)生在肝臟，產(chǎn)生25-羥基維生素D，第2次羥基化主要發(fā)生在腎臟，產(chǎn)生具有生物活性代謝物1,25-二羥維生素D。當(dāng)1,25-（OH）2D足量時(shí)，它可進(jìn)一步在腎臟轉(zhuǎn)化為24,25-（OH）2D，最后發(fā)生分解代謝。循環(huán)中的25-羥基維生素D的半衰期為2-3周。

因此，在醫(yī)學(xué)上，對(duì)血液中25-羥基維生素D的檢測經(jīng)常被用于確定體內(nèi)維生素D的含量，血液中25-羥基維生素D的濃度被認(rèn)為是體現(xiàn)人體維生素D狀態(tài)的較佳指標(biāo)。

2015年公開專利CN104969067A《維生素D的測定方法及測定用試劑盒》提及小分子夾心法，摘抄部分內(nèi)容如下。

使用抗體作為具有維生素D親和性的物質(zhì)的情況下，可以進(jìn)一步使用二抗。作為二抗，可以為維生素D的抗體（一抗）的一抗部分的抗體，也可以為維生素D及一抗的復(fù)合物的抗體。二抗等抗體可以與檢測用物質(zhì)連接。

2024年公開專利CN117871874A《小分子物質(zhì)免疫檢測方法》對(duì)小分子夾心法的反應(yīng)原理做了詳細(xì)闡述，摘抄部分內(nèi)容如下。

本發(fā)明提出了一種小分子物質(zhì)免疫檢測方法，其特征在于，包括：（1）將含有小分子物質(zhì)的樣本、配體、第二抗體和表面活性劑進(jìn)行反應(yīng)，得到小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物，且所述小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物中小分子物質(zhì)誘導(dǎo)配體形成至少一個(gè)新的構(gòu)象表位，所述第二抗體可特異性結(jié)合所述至少一個(gè)新的構(gòu)象表位，所述表面活性劑可消除所述第二抗體與構(gòu)象未改變的配體之間的結(jié)合；（2）檢測所述小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物。

樣本中的小分子物質(zhì)與配體發(fā)生特異性結(jié)合，得到小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物，并且小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物中小分子物質(zhì)誘導(dǎo)配體形成至少一個(gè)新的構(gòu)象表位。小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物與第二抗體和表面活性劑反應(yīng)，第二抗體特異性地與形成新構(gòu)象表位的配體結(jié)合，同時(shí)也會(huì)與構(gòu)象未改變的配體產(chǎn)生弱結(jié)合。表面活性劑可消除第二抗體與構(gòu)象未改變的配體之間的結(jié)合，得到小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物。通過檢測三元復(fù)合物，可以實(shí)現(xiàn)小分子物質(zhì)檢測。由此，采用雙抗體夾心法可以提高檢測準(zhǔn)確性和靈敏度，不同濃度梯度樣本檢測區(qū)分度高。同時(shí)，減少了篩選高特異性復(fù)合物抗體的難度，更有利于小分子物質(zhì)檢測試劑盒的大規(guī)模生產(chǎn)和檢測，應(yīng)用價(jià)值高。

針對(duì)25-羥基維生素D抗原的檢測（夾心法），西寶生物推出2種抗體及3種解離劑。

25-羥基維生素D抗體（貨號(hào)：ECY4531B）識(shí)別抗原抗體復(fù)合物；

具體性能如下（以下評(píng)估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗(yàn)證，建議客戶根據(jù)自身工藝進(jìn)行更為詳細(xì)的驗(yàn)證）。

線性范圍：1.5ng/mL-150ng/mL；最低檢出限：1.5ng/mL。

2.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)    

線性范圍：1.5ng/mL-150ng/mL；最低檢出限：1.5ng/mL。

線性范圍：5ng/mL-100ng/mL；最低檢出限：5ng/mL。

3.1.1 西寶生物發(fā)光（AE）平臺(tái)25-羥基維生素D抗體配對(duì)組合1與質(zhì)譜法賦值的臨床樣本相關(guān)性R2>0.95，相關(guān)性良好；

3.1.2西寶生物發(fā)光（AE）平臺(tái)25-羥基維生素D抗體配對(duì)組合1與羅氏診斷的25-羥基維生素D試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2在0.90左右，相關(guān)性較好。

3.2.1西寶生物發(fā)光（AP）平臺(tái)25-羥基維生素D抗體配對(duì)組合2與質(zhì)譜法賦值的臨床樣本相關(guān)性R2在0.95左右，相關(guān)性良好；

3.2.2西寶生物發(fā)光（AP）平臺(tái)25-羥基維生素D抗體配對(duì)組合2與羅氏診斷的25-羥基維生素D試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2＞0.90，相關(guān)性較好。

西寶生物熒光免疫層析平臺(tái)25-羥基維生素D抗體配對(duì)組合3與羅氏診斷25-羥基維生素D試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2＞0.90，相關(guān)性較好。

樣本:樣品加樣量10ul；

試劑1：25-羥基維生素D抗體（貨號(hào)：ECY4531B）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：25-羥基維生素D抗體（貨號(hào)：ECY4531C）標(biāo)記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；

試劑3：25-羥基維生素D解離液（發(fā)光專用1）（貨號(hào)：DCH0207B）/25-羥基維生素D解離液（發(fā)光專用2）（貨號(hào)：DCH0207A）

第一步：10ul樣本+50ul試劑1+50ul試劑2+80ul試劑3混合，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，進(jìn)行測試。

樣本:樣品加樣量10ul/20ul；

試劑1：25-羥基維生素D抗體（貨號(hào)：ECY4531B）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：25-羥基維生素D抗體（貨號(hào)：ECY4531C）標(biāo)記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；

試劑3：25-羥基維生素D解離液（發(fā)光專用1）（貨號(hào)：DCH0207B）/25-羥基維生素D解離液（發(fā)光專用2）（貨號(hào)：DCH0207A）

第一步：10ul/20ul樣本+50ul試劑1+50ul試劑2+80ul試劑3混合，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入底物，進(jìn)行測試。

樣本:加樣量10ul；

反應(yīng)條件：10ul樣品+100ul 25-羥基維生素D解離液（熒光層析專用）（貨號(hào)：DCH0207C）混勻（無需等待解離），上樣，反應(yīng)時(shí)間（10min-15min）；

測試使用熒光儀器:和邁FIC-S100。

目前，由于維生素D檢測的標(biāo)準(zhǔn)化工作剛剛起步，各種檢測方法間存在著明顯的結(jié)果差異，尤其是商業(yè)化方法以及不同實(shí)驗(yàn)室的自建方法。

1.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）作為小分子檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然特異性好、準(zhǔn)確度高，但其通量小、前處理復(fù)雜、對(duì)設(shè)備和人員要求高，更重要的是出報(bào)告時(shí)間超過6小時(shí)，且無法當(dāng)天出報(bào)告，因此難以廣泛使用。

2.主流化學(xué)發(fā)光廠家檢測維生素D的主要方法還有競爭法。

3.雙抗夾心法相較于競爭法在靈敏度、特異性和檢測范圍均有明顯優(yōu)勢，使用小分子夾心法檢測維生素D近年得到了廠商和臨床端越來越多的認(rèn)可。

西寶生物作為體外診斷上游原料供應(yīng)商，除上述新開發(fā)的夾心法抗原抗體試劑原料，還能提供競爭法相關(guān)試劑.詳情如下：